Coordonator:Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Centrul MICROGEN, Director proiect:Conf Dr Natalia Cucu, (membrii echipei de cercetare: cercetatori Centrul de Cercetare MICROGEN in colaborare cu Prof Dr Otilia Zarnescu de la Centrul de Cercetare BCUM)
Partener 1:Institutul de Virusologie “Stefan S. Nicolau” Bucuresti, departamentul de Biologie Moleculara, Responsabil proiect: CSI Dr Gabriela Anton, sef departament si membrii echipei: CS Drd Anca Botezatu, CSI Dr Lorelei B)
Partener 2: Institutul de Cercetare Dezvoltare pentru Stiinte Biologice Bucuresti, Centrul de Bioanalize, Responsabil proiect: CSIII, Dr. Camelia Albu (membrii echipei: Prof Dr Lucian Gabriel Radu, CSI Dr Simona Litescu)
Patener 3: Spitalul Clinic Cf2 Bucuresti, Departamentul de Obstetrica Ginecologie, Laboratorul de Genetica din cadrul Sectiei de Reproducere Asistata, Responsabil proiect: Lector Dr Eugen Tanase, responsabil stiintific: CSI Dr Marioara Matei (membru al echipei- oncolog Dr Mihaela Crihana)
Partener 4: Institutul de Medicina Comparata din cadrul Universitatii de Stiinte Agronomice si Medicina Veterinara Bucuresti, Responsabil proiect: Conf Dr ADNrei Ovidiu Tanase (membrii echipei: Prof. Dr. Nicolae Cornila si Lector Dr Jacqueline Mocanu).
Cercetarile intreprinse in domeniul oncologiei clinice si experimentale din ultimele aproximativ trei decade au condus la conturarea unor concepte fundamentale privind originea si evolutia bolii canceroase bazate pe etiologia multifunctionala, dezvoltarea secventiala, transformarea fenotipica a celulelor normale datorata unei reprogramari a expresiei genice celulare induse de mutatii sau de genele virale, dar si implicarea deopotriva a factorilor epigenetici. Experienta acumulata in practica strategiilor mentionate nu a dovedit totusi eficienta scontata initial, mai ales in ceea ce priveste mecanismul initierii transformarii genetice in celulele normale, cat si aspectele de susceptibilitate individuala.
Modelul de studiu ales a fost cancerul mamar, motivul alegerii fiind determinat de incidenta mare crescuta a acestei maladii in lume si in tara noastra, de frecventa crescuta a cancerelor mamare nonfamiliale si, totodata, de posibilitatea utilizarii unui model animal (modelul canin), care ofera o incidenta similara, crescuta si corelata cu factorii ambientali.
Studiul (finantat de Programul National Viasan in 2006 prin proiectul nr.117) a implicat definirea unor markeri epigenetici cu relevanta in validarea diagnosticului stabilit de catre partenerii (Spitalul Clinic CF2 Bucuresti si Institutul de Medicina Comparata) proiectului prin analizele clinice si paraclinice rutinale atat in tesuturi tumorale, cat si in sange periferic.
Obiectivele majore ale proiectului au vizat urmatoarele aspecte:
(I) Initierea unei retele de cercetare complexa avADN drept scop studiul morfogenezei cancerului genito-mamar si a precursorilor sai prin integrarea unor institute specializate in cercetarea fundamentala a mecanismelor moleculare genetice/epigenetice alaturi de specialisti din domeniul cercetarii clinice si practicieni din unitati sanitare.
(II) Abordarea complexa a acestei forme maligne si a leziunilor de granita vizeaza, pe langa dezvoltarea cunostintelor stiintifice in domeniu, definirea unor noi markeri biologici, cu relevanta in aprecierea gradului de severitate a bolii, pe baza selectiei fenotipurilor moleculare specifice.
(III) Cuantificarea unor markeri genetici si epigenetici si integrarea lor cu rezultatele examenelor clinice si paraclinice stADNardizate pentru cancerul genito- mamar care sa ofere posibilitatea modelarii matematice si formularea unui algoritm diagnostic cu implicatii directe asupra prognosticului terapiei si evolutiei cazului individualizat.
(IV) In afara obiectivelor masurabile, care apartin aspectelor sferei de cercetare, proiectul isi propune familiarizarea medicilor practicieni (ginecologi, oncologi, morfopatologi) cu metode si tehnici moderne de operare in caracterizarea diferitelor etape de dezvoltare neoplazica, menite sa ofere o mai mare exactitate in alegerea si individualizarea atitudinii terapeutice.
(V) Proiectul ofera, prin initierea colaborarii propuse in realizarea obiectivelor, specializarea laboratoarelor de analiza in aplicarea tehnicilor specifice domeniului epigeneticii in cancer, interpretarea si modelarea matematica a rezultatelor pentru aprecierea sensibilitatii, specificitatii, acuratetei si a coeficientului de siguranta a fiecarei metode in parte, in vederea integrarii lor in algoritmul diagnostic si terapeutic.
Studiul a implicat abordarea metabolismului grupei metil ca marker candidat al instabilitatii genomice induce de procesele cancerigene. S-a estimat in acest sens dinamica aberanta a proceselor de metilare enzimatica la nivelul ADN (hipometilarea globala ADN si hipermetilarea locala ADN - in gene critice pentru acest tip de cancerogeneza), cat si la nivelul unei histone octamerice cu rol important in silentierea aberanta a genelor tumor supresor studiate (histona H3). Aceste procese au fost corelate cu expresia genica represata in gena critica pentru cancerul mamar (BRCA1). O abordare comparativa a estimarii mutatiilor in aceasta gena, cat si in alte gene tumor supresor a permis o evaluare generala a implicarii celor doua tipuri de modificari ale ADN (modificare genetica sau mutatie si modificare epigenetica) si, totodata, o evaluare relativa a ponderii cancerului familial in cazurile luate in studiu.
Rezultatele obtinute in decursul desfasurarii proiectului au condus la urmatoarele concluzii:
(i) Metodele epigenetice de PCR specific siturilor ADN metilate si restrictie sensibila la metilare au fost utilizate in estimarea hipermetilarii locale (Inst Virusologie), respectiv in promotorii unor gene tumor supresoare critice: BRCA1 si 2, Estrogen Receptor alpha ER alpha), Receptorul Acidului Retinoic (RAR) beta, P53, E-cadherina, p16, p21 etc, concomitent cu hipometilarea globala ADN (UnivBuc). Aceste procese de metilare ADN aberanta au fost corelate cu instabilitatea genomica globala si locala, care ar explica totodata si frecventa crescuta a aneuploidiilor.
(ii) Implicarea modificarilor histonice (metilarea si deacetilarea) cu efecte asupra expresiei genelor tumor supresoare (ER alpha si BRCA1) a fost studiata prin metode directe, de evidentiere imunohistochimica a histonei H3 modificata covalent in restul de lizina 9 (H3K9trimetilata) (Univ Buc) in compartimentele celulare si indirect, prin intermediul tratamentelor cu inhibitori de histondeacetilaze (HDAC) (Univ Buc si Inst Virusol), al caror efect de reactivare genica a implicat reacetilarea regiunilor promotor s-a soldat cu reactivarea genica a unor gene critice pentru proliferarea celulara.
(iii) Studiul expresiei genice a fost abordat la nivel proteic (prin detectia imunohistochimica a genelor BRCA1 si ERalpha) (Univ Buc) si la nivelul ARNm (in studiul reactivarii genelor p16, p21 si p53 prin tratamente cu inhibitori HDAC) (Univ Buc si Inst Virusol).
(iV) Un alt marker epigenetic important a fost considerat metabolismul celular al grupei metil, care a implicat nu numai detectia HPLC a donorului de grupe metil S-adenozilmetionina (SAM) si a produsului sau S-adenozilhomocisteina (SAH) (INSB), dar si analiza polimorfismului genei pentru metilentetrahidrofolatreductaza (MTHFR) (Inst Virusol).
Proiectul a dezvoltat metodologii specifice domeniului epigeneticii pentru definirea unor markeri epigenetici relevanti pentru setul de gene critice alese in studiul cancerogenezei mamare, algoritmul de analiza propus fiind complementar celui de analize clinice si paraclinice utilizat in diagnosticul uzual.
Prin identificarea tintelor epigenetice implicate in remodelarea cromatinei si reprogramarea genetica s-a propus o noua atitudine terapeutica, bazata pe reversibilitatea modificarilor epigenetice aberante care au condus la silentierea genelor tumor supresoare critice pentru stabilizarea genomica si, in special pentru procesele de proliferare. Aceasta a implicat un studiu de optimizare a modelului experimental de reactivare genica prin intermediul tratamentelor in vitro a liniilor celulare derivate din tumori canide cu inhibitori ai enzimelor histondeacetilaze. Acesti compusi sunt in prezent in centrul atentiei laboratoarelor specializate din lume ca potentiale substante active ale unor noi medicamente citostatice.
Obiectivele majore, rezultate scontate, justificarea si colaborarile propuse in vederea realizarii proiectului
Obiectivele majore ale proiectului vizeaza urmatoarele aspecte:
(I) Initierea unei retele de cercetare complexa avADN drept scop studiul morfogenezei cancerului mamar si a precursorilor sai prin integrarea unor institute specializate in cercetarea fundamentala a mecanismelor moleculare genetice/epigenetice alaturi de specialisti din domeniul cercetarii clinice si practicieni din unitati sanitare.
(II) Abordarea complexa a acestei forme maligne si a leziunilor de granita vizeaza, pe langa dezvoltarea cunostintelor stiintifice in domeniu, definirea unor noi markeri biologici, cu relevanta in aprecierea gradului de severitate a bolii, pe baza selectiei fenotipurilor moleculare specifice.
(III) Cuantificarea unor markeri genetici si epigenetici si integrarea lor cu rezultatele examenelor clinice si paraclinice stADNardizate pentru cancerul mamar care sa ofere posibilitatea modelarii matematice si formularea unui algoritm diagnostic cu implicatii directe asupra prognosticului terapiei si evolutiei cazului individualizat.
(IV) In afara obiectivelor masurabile, care apartin aspectelor sferei de cercetare, proiectul isi propune familiarizarea medicilor practicieni (ginecologi, oncologi, morfopatologi) cu metode si tehnici moderne de operare in caracterizarea diferitelor etape de dezvoltare neoplazica, menite sa ofere o mai mare exactitate in alegerea si individualizarea atitudinii terapeutice.
(V) Proiectul ofera, prin initierea colaborarii propuse in realizarea obiectivelor, specializarea laboratoarelor de analiza in aplicarea tehnicilor specifice domeniului epigeneticii in cancer, interpretarea si modelarea matematica a rezultatelor pentru aprecierea sensibilitatii, specificitatii si acuratetei si a coeficientului de siguranta a fiecarei metode in parte, in vederea integrarii lor in algoritmul diagnostic si terapeutic.
Prezentul proiect este prin obiectivele vizate in conformitate cu obiectivele si prioritatile programului CEEX, respectiv ale ariilor tematice:
1.1.1 Cercetare completă. Urmărind stimularea progresului experimental în cercetarea biomedicală, prin imbunătăţirea generării, stADNardizării, achiziţiei şi analizei datelor;
1.1.4. Procese si biotehnologii pentru sanatate, studii terapeutice si interventii inovative, urmarind dezvoltarea ulterioara a proceselor esentiale pentru succesul terapiilor inovative, cu aplicare potentiala in tratarea unor boli si tulburari medicale.
1.2.1. Transferul rezultatelor cercetarii pentru asigurarea sanatatii umane. Integrarea informatiilor si porceselor biologice: colectarea de informatii ample, urmarind generarea si analiza unui numar masiv de informatii cu scopul de a intelege mai bine retelele complexe de mii de gene si produse de gene care controleaza procese biologice importante.
Colaborari prevazute pentru realizarea obiectivelor majore ale proiectului
In Romania, abordarea epigenetica a fost initiata la Facultatea de Biologie, Universitatea Bucuresti, Catedra de Genetica Generala, prin activitatea didactica de predare a cursului de Epienomica si a lucrarilor practice aferente. Cursurile de organisme modificate genetic si transgeneza/clonare/terapie genica sunt de asemenea completate cu notiuni de epigenetica pentru explicarea efectelor aplicarii tehhnicilor predate. Centrul de cercetare (Institutul de Genetica) din cadrul Universitatii Bucuresti este, de asemenea, preocupat, prin colaborarea cu institute de cercetare (INSB si Virusologia) si alte centre universitare si spitale de implementarea tehnicilor de analiza epiggenetica (detectia nivelului genomic de metilare ADN prin restrictia cu perechi de enzime izoschizomere, si detectia metilarii ADN in situ, prin hibridizare Southern ; recent, laboratorul a realizat localizarea cromozomala a regiunilor genomice metilate cu anti 5 metilcitozina si analiza ChIP a cromatinei in gametogeneza in sistemul animal-la Urodele). Institutul de Virusologie a initiat recent cercetari in domeniul factorilor epigenetici implicati in cancerul de col uterin, iar INSB are deja experienta in analiza HPLC a raportului concentratiilor SAM/SAH si Hcis. Este deci imperios necesar ca, in urmatorii ani, comunitatea stiintifica, in deosebi in domeniul cancerului, din tara noastra sa se alinieze la aceste orientari, achizitionADN informatiile fundamentale despre domeniul epigeneticii si aplicADN tehnicile moderne de biologie moleculara si matematice, specifice acestui domeniu.
Proiectul preconizeaza integrarea frecventelor alterarilor genetice, epigenetice si biochimice, precum mutatiile, respectiv metilarea ADN si modificarile histonice (metilare, acetilare, deacetilare) ale genelor considerate cADNidat pentru definirea cancerului mamar in tabloul modificarilor sintetizate de diagnosticul clinic si paraclinic uzual. Estimarile alterarilor moleculare la nivelul genomic, respectiv ADN si histone, vor fi corelate totodata cu nivelul metabolismului celular al grupelor metil, prin intermediul introducerii indicatorilor nutrigenomici, precum raportul donorului de grupe metil (S-adenozilmetionina, SAM) fata de biomoleculele derivate din acesta, S-adenozilhomocisteina (SAH) si, respectiv, Homocisteina (Hcis), cat si a substantelor care remediaza metabolismul deficient al acestor grupe: folati, vitamine B. Acestia vor completa tabloul individualizat al cazurilor de cancer, prin elaborarea unui model matematic capabil sa orienteze strategiile terapeutice si de diagnostic
Proiectul propus isi justifica interesul prin:
(1)subiectul abordat ,acela al implicarii modificarilor epigenetice in cancer, care constitue o noua abordare in cercetarea oncologica in lume si o premiera la noi in tara,
(2)aria de aplicatie a investigatiilor epigenetice, deoarece ea se refera la o afectiune maligna corelata cu rate ridicate de incidenta si moratalitate la om si la animale, cu raspunsuri variate la terapie,cu un impact psihologic si social considerabil si cu costuri ale terapiilor si ale programelor de recuperare considerabile
(3)prin faptul ca ofera posibilitatea unei cercetari comparative, inserADN modelul animal,oferit de cancerele mamare spontane si nu cel al tumorilor induse sau de transplant utilizate atat de mult in cercetarea oncologica
(4)reuneste un grup de specialisti din domenii variate ale cercetarii fundamentale,ale clinice medicale umane si ale patologiei clinice veterinare,oferind cadrul unui dialog interactiv si posibilitatea unor evaluari de etapa si finale pertinente.
Perspective si rezultate scontate
Sansele de succes ale proiectului au la baza au la baza urmatoarele consideratii:
(1)alterarile epigenetice premerg frecvent celor genetice, putADN fii markeri de diagnostic diferential pentru precursorii cancerului,respectiv a leziunilor boderlane;
(2)reversibilitatea alterarilor epigenetice ofera posibilitatea interventiei prin factori terapeutici ca agenti reglatori ai proceselor epigenetice, permitADN restaurarea fenotipului celular normal, ceea ce ofera posibilitatea introducerii lor in strategiile de preventie
(3)abordarea paralela in cadrul cercetarilor a unor factori etiologici asociati cu cancerul mamar ,inclusiv comportamentul alimentar ,fumat,aport excesiv de estrogeni,cu fenotipurile epigenetice intilnite in cancer, ofera argumente in plus asupra rolului esential al surprinderii momentului alterarilor epigenetice reversibile si includerii lor in strategiile de preventie;
(4)contributiile previzibile la definirea aspectelor multiple specifice cancerului mamar sunt posibile prin integrarea tehnicilor de diagnostic clinic si paraclinic cu metode de analiza genomica, implicADN un numar relativ mare de gene,situate la nivelul structural primar(secventa de ADN),la nivelul conformatiei cromatnice cat si la nivelul expresiei lor fenotipice
(5) se aliniaza din punct de vedere stiintific la cele doua mari proiecte ce se deruleaza la ora actuala in lume:Epigenome Project (initiat in 2000) si Programul UE in domeniul epigenetic din etapa FP6.
(6) din punct de vedere practic se aliniaza la un obiectiv prioritar al politicilor sanitare care urmaresc influentarea pozitiva a starii de sanatate a populatiei , prin promovarea domeniilor de varf din cercetare si dezvoltarea de noi linii in diagnosti si terapie . Viabilitatea proiectului este asigurata de faptul ca el raspunde unor cerinte reale ale cercetarii fundamentale si aplicative,iar garantia derularii sale conform obiectivelor propuse este reprezentata de competentele unei echipe multidisciplinare formate din specialisti ce acopera intreaga problematica,de initierea deja a unui dialog cu centre de referinta din lume( intre careCNIO-Spania) .Riscurile pe care proiectul si-l asuma este corelat cu dicultatile ce pot apare in procurarea unui numar reprezentativ de probe biologice care sa asigure un coeficient de siguranta al interpretarii rezulatelor si o modelare matematica plurifactoriala a acestora in final precum si cu costurile ridicate ale analizelor /per caz ca –re impune o finantare conform planificarii.
Infrastructura si managementul responsabilitatilor
Initierea retelei de epigenetica prin desfasurarea proiectului de fata implica o colaborare intre urmatoarele institutii: Universitatea Bucuresti (UB), Departamentele Genetica (G), BCUM (B) si Biofizica (BF) Conducator proiect; Parteneri: P1- Institutul de Stiinte Biologice Bucuresti (INSB), Departamentul Bioanalize si Microscopia electronica, P2- Institutul de Virusologie “Stefan Nicolau” (VIR), Departamentele Biochimie (B), Culturi celulare (C) si Prelucrare matematica (M), P3- Spitalul CFRII (CF), si P4- Institutul de medicina Comparata (IMC)
Etape si Responsabilitati
(1)Comitetul conducator (UB si reprezentantii partenerilor)-Stabilirea infrastructurii , a resposabilitatilor, modelelor experimentale de analiza moleculara genetica (VIR-UBB), epigenetica (UBG_UBB), biochimica (INSB), imunohistochimica (BCUM), citologica (citologie clasica-FISH: UBG-CF, microscopie electronica:UBB-INSB, flow citometrie: VIRC)
(2)CF/IMC-Selectarea cazurilor (diagnostic clinic si paraclinic, dc si dpc), analiza oncologica primara cu markeri tumorali uzuali: CF (cancer mamar uman, cmu) si IMC (cancer mamar animal, cma)
(3) CF-Initierea colectiei probelor umane/animale (sange periferic venos, tumori solide), prelucrarea initiala (ser, parafina, formol), corespunzatoare modelelor experimentale de analize si repartitia materialului biologic la laboratoarele de analiza specializata
(4) VIR-Initierea si intretinerea colectiei de ADN si repartitia probelor la laboratoarele de analiza specializata
(5) VIR-Initierea, intretinerea si tratamentul culturilor celulare derivate din tumori: VIRC
Analizele materialelor biologice prelucrate vor fi efectuate in cadrul fiecarei etape astfel:
INSB-Analiza biochimica HPLC: (i) estimarea gradului general de metilare in cadrul ADN genomic (probe ADN genomic), (ii) estimarea concentratiei celulare SAM, SAH si Hcis si a rapoartelor dintgre acestea (probe ser extras din sange periferic venos).
UBG-CF- Analiza citogenetica a aberatiilor cromozomale (clasic) asociate cu alterari in anumite gene (FISH) asociate cu cancerul mamar (HER) si cu alterari in pattern-ul de repartitie cromozomala a regiunilor metilate (5mC cu anticorp anti 5mC) in preparate cromozomale obtinute din culturi limfocitare obtinute, pe termen scurt, din sange periferic venos.
UBB-INSB- Analiza electronomicroscopica a preparatelor tisulare tumorale privind dinamica structurilor cromatinice.
UBG- Analiza ChIP a cromatinei izolate din nuclei sedimentati din sange si din cluturi celulare derivate din tumori, pentru detectia, concomitent cu secventa genica tsg, a factorilor epigenetici definitorii pentru structuri cromatinice active/inactive transcriptional
UBG-Analiza epigenetica moleculara:
(i) estimarea nivelului general de metilare a ADN (analiza comparativa a pattern-urilor de restrictie a ADN genomic cu perechi de enzime izoschizomere),
(ii) estimarea in situ (in promotorul si exonul 1 tsg) a metilarii insulelor CpG (MS-PCR, methylation sensible PCR si Bisulfit – PCR ).
VIR- Analiza mutatiilor in tsg: PCR.
UBB- Analiza secventelor (secventierea) ampliconilor obtinuti din analizele moleculare genetice/epigenetice.
UBB- Analiza imunohistochimica a preparatelor tisulare (tumori) si celulare (culturi derivate din tumori) pentru estimarea activitatii factorilor epigenetici definitorii pentru conformatii cromatinice active/inactive.
VIRB- Analiza flow citometrica a ciclului celular in culturile celulare tratate/netratate cu agenti epigenetici (inhibitori de ADNMT si HDAC) si cu agenti nutrigenomici.
Departamentele UBBF-VIRM-vor realiza Analiza matematica a datelor si stabilirea modelelor matematica de interpretare integrativa a testelor de tip high throughput aplicate in cazul considerarii factorilor si genelor implicate in tumorigeneza mamara.
De asemenea, in activitatile finale, UBG, VIRB – Validarea oncochip-urilor achizitionate de la laboratoarele de specialitate (Centru de investigatii oncologice CNIO-Madrid)..
UBG-INSB – Integrarea rezultatelor privind implicarea factorilor nutrigenomici (ADN metilare genomica, raportul SAM/SAH/Hcis in diagnostic si tratamente nutrigenomice, completate cu fisele indicative ale stilului de viata, dieta si conditiile de poluare ale mediului pentru fiecare caz uman/animal).
UBG, VIRB, INSB, CF, IMC-Integrarea rezultatelor privind modelul animal/uman de studiu genetic/epigenetic al morfogenezei tumorilor mamare; stabilirea comparativa a procentelor de alterari genetice epigenetice pe cazurile luate in studiu. Intocmirea unui raport integrativ privind atitudinea epigenetica in diagnosticul timpuriu si de prognoza a tumorigenezei, respectiv a monitorizarii tratamentului propus..
UBG, VIRBC- Integrarea rezultatelor privind efectul agentilor epigenetici de reprogramare a dinamicii tsructurale cromatinice (inhibitori ADNMT si HDAC) in vederea intocmirii unui raport privind atitudinea terapeutica epigenetica si utilizarea acesteia intr-un studiu amplu pe aceasta tema, comparativ sau in completarea abordarilor clasice (citostatice).
Responsabilitatile partenerilor si managementul activitatilor
Fluxul materialului biologic si al activitatilor de analiza se va desfasura astfel:
1. Selectarea cazurilor de cancer mamar la animale si om pe baza criteriilor clinice si paraclinice (CF,IMC).
2. Colectarea probelor de tesut/sange (CF/IMC)
3. Completarea fiselor individuale cu rezultatele examenelor clinice si paraclinice (CF)
4. Prelucrarea materialului biologic si stocarea sa adecvata in vederea repartitiei pe grupuri de lucru (CF)
5. Achizitia si intretinerea liniilor celulare stADNard derivate din tumori mamare si caracterizate prin mecansime specifice de inducere a cancerului mamar (CF).
6. Initierea si intretinerea culturilor celulare pe termen scurt, pentru realizarea analizei citogenetice; obtinerea preparatelor cromozomale si analiza citogenetica (detectia fenomenului PCD-premature chromatide dissociations si de aneuploidie; detectia genei HER2.neu) (CF si UBG)
7. Tratamentul epigenetic al culturilor celulare stADNard cu inhibitori ai enzimelor implicate in modelarea conformatiei cromatinice; pregatirea probelor biologice derivate din culturi tratate/netratate pentru analizele genetice/epigenetice (CF,UBG).
8. Completarea fiselor individuale cu rezultatele analizelor genetice/epigenetice realizate de catre grupurile de specialisti din cadrul institutelor partenere.
9. Repartitia tesuturilor si a depozitelor celulare pentru analiza IHC si electronomicroscopica (UB_BCUM/UBG). Pregatirea preparatelor tisulare, marcarea cu anticorpi si colorarea cu substrate cromo-fluorogene, vizualizarea conformatiilor cromatinice si a localizarii moleculelor importante in procesele epigenetice de silentiere/reactivare a genelor.
10. Repartitia tesuturilor/depozitelor celulare/fluidelor biologice (fluide obtinute prin spalari ductale, sange periferic venos) pentru izolarea si purificarea ADN. Initierea si intretinerea bancii de ADN (VIRG). Repartitia probelor ADN pentru a fi analizate prin MS-PCR si HPLC.
11. Pregatirea probelor ADN pentru analiza gradului de metilare in promotorii genelor vizate: mtageneza cu bisulfit si purificarea ADN rezultat (VIRG)
12. Analiza genetica: detectia PCR a mutatiilor in genele vizate-BRCA1, BRCA2, p16, σ, RARß, ER, PR (VIRG).
13. Initierea si intretinerea culturilor celulare derivate din tesuturile tumorale VIRC
14. Tratamentul culturilor celulare cu molecule implicate in modelarea cromatinei si cu substante nutrigenomice (folati, vit B12, Vit B6, colina si fitopreparate cu rol citostatic) (UBG,CF,VIRC). Obtinerea de depozite celulare si repartitia lor catre grupuri de specialisti in vederea realizarii analizelor genetice/epigenetice.
15. Analiza preparatelor ADN pregatit prin mutageneza cu bisulfit in vederea detectiei nivelului de metilare (MS-PCR) (UBG)
16. Izolarea cromatinei si realizarea tehnicii ChIP din preparatele tisulare si culturi celulare (UBG).
17. Secventierea ampliconuilor rezultati in urma reactiei MS-PCR pentru verificarea rezultatelor analizei epigenetice (UB-BCUM).
18. Analiza HPLC a concentartiei globale relative in 5 metil citozina (nivelul general de metilare ) al ADN (INSB).
19. Analiza HPLC (in probe de sange si tesut) a moleculelor SAM/SAH si Hcys. Estimarea variatiei rapoartelor acestor molecule implicate in metabolismul grupei metil si corelarea rezultatelor cu tratamentele in cultura celulara cu substante nutrigenomice (folati, etc).(INSB).
20. MS-restrictia ADN genomic pentru estimarea gradului general de metilare al ADN (UBG).
21. Analiza epigenetica utilizADNu-se oncochip-uri achizitionate de la laboratoare specializate (CNIO-Spania) (UBG/INSB/VIRG).
22. Prelucrarea si integrarea rezultatelor; validarea algoritmurilor matematice din literatura de specialitate (UBG, UBM, VIRG si VIRM, CF).
23. Elaborarea rapoartelor de cercetare si financiare integrate (UBG/CF).
