Proiect PNII - IDEI nr. 985/2009
Cod CNCSIS 1963
Titlul proiectului: BIODIVERSITATEA LEVURILOR DE INTERES BIOTEHNOLOGIC - ANALIZA MOLECULARA A GENOMULUI SI STUDII DE METABOLISM.
Echipa de cercetare a proiectului /2010:
director de proiect - Conferenţiar dr. Ortansa Csutak
membrii în echipa de cercetare – Prof. dr. Tatiana Vassu
CSIII dr. Raluca Ghindea
ACS dr. Oana Negruţă
Descrierea proiectului
Levurile (drojdiile) non-convenţionale şi-au găsit variate aplicaţii biotehnologice, fiind capabile să consume, transformând în biomasă, compuşi care nu constituie surse convenţionale de carbon, utilizate de către majoritatea drojdiilor. În prima etapă (2009) a proiectului nostru am realizat analize morfo-fiziologice şi ale genomului nuclear, care au permis încadrarea taxonomică preliminară a celor 10 tulpini de levuri selectate pentru studiu.
Pornind de la aceste premise, în al doilea an de finanţare ne-am propus şi am realizat identificarea taxonomică acurată şi analiza biodiverităţii tulpinilor selectate.
Obiective realizate în cursul anului 2010, anul II de finanţare: Toate obiectivele propuse pentru prezentul an de finanţare au fost îndeplinite:
1. Studiul comparativ al genomului extranuclear s-a axat pe analiza ADN plasmidial de tip 2m-like şi pe determinarea fenotipului killer, cu optimizarea condiţiilor tulpină-specifice de izolare a ADN plasmidial şi selectarea tulpinilor test pentru fenotipul killer. Nici una dintre tulpinile noastre nu a prezentat aceste caractere extranucleare.
2. Identificarea markerilor moleculari utili pentru analiza biodiversităţii tulpinilor şi speciilor de levuri a implicat detalierea importanţei analizei structurii moleculelor de ARN ribozomal şi a tehnicii RAPD în studii de taxonomie şi biodiversitate a levurilor, prin consultarea informaţiilor de mare actualitate din literatura de specialitate. Au fost selectaţi ca markeri moleculari secvenţa ITS1-5,8S-ITS2 şi secvenţele de ADN genomic amplificate randomic prin RAPD.
3. Experimentarea şi optimizarea tehnicilor de biologie moleculară pentru analiza markerilor moleculari a implicat (1) optimizarea parametrilor amplificării PCR a secvenţei ITS1-5,8S-ITS2; (2) stabilirea condiţiilor reacţiei ARDRA pe ampliconii obţinuţi; (3) optimizarea condiţiilor necesare pentru reproductibilitatea tehnicii RAPD. Rezultatele obţinute au relevat: (a) 91,4% identitate între DP3 şi Issatchenkia orientalis; (b) grade de similitudine între Rhodotorula glutinis CBS20Tşi DP1 – 88,2%, DP2 – 91% şi DP4- 83.80%; (c) tulpina BC prezintă similaritate cu tulpina LC (identificata drept I. orientalis prin secvenţierea regiunii D1/D2 ADNr 26S, date nepublicate); (d) profilul şi dimensiunea fragmentelor de restricţie obţinute pentru tulpina CS pot fi considerate ca noi argumente în sprijinul apartenenţei acestei tulpinii la specia Kluyveromyces marxianus; (e) tulpinile ICCF 453, ICCF 15 şi ICCF 50, aparţin speciei Hansenula polymorpha.
4. Utilizarea markerilor moleculari identificaţi în studii de biodiversitate şi taxonomie a levurilor selectate În scopul realizării acestor studii, au fost realizate mai multe experimente RAPD care utilizau acelaşi primer – OPA03 – pentru amplificarea ADN genomic provenit de la tulpinile noastre şi numeroase tulpini de referinţă. O parte dintre profilurile de amplificare astfel obţinute au fost computerizate, introduse în programul Quantity One (BioRad) şi cuantificate în dendrograme folosind metoda UPGAMA. S-a confirmat astfel gradul mare de înrudire dintre tulpinile BC, LC şi DP3 care aparţin speciei Issatchenkia orientalis. Tulpina DP4 a fost identificată ca aparţinând cel mai probabil speciei Rhodotorula glutinis. Tulpinile CS si YP16, au prezentat profiluri RAPD similare, putând fi considerate conspecifice, aparţinând probabil speciei Kluyveromyces lactis.
Indicatori de performanţă realizaţi:
Conform actului adiţional nr. 1/2010: Articol ştiinţific publicat în revistă cotată ISI:
Ortansa Csutak, Raluca Ghindea, Ileana Stoica, Ana-Maria Tanase, Tatiana Vassu , 2010, Identification of two yeast strains from oil-polluted environment by RFLP on ITS-5.8S rDNA and RAPD analysis, Roum. Biotechnol. Lett., (accepted)
!! Indicatori suplimentari:
1. Tatiana Vassu, Ileana Stoica, Ortansa Csutak, 2010, Cap. 4. Elemente de taxonomie moleculară la microorganisme, În: Genetică şi Inginerie genetică. Note de curs, Ed. Universităţii din Bucureşti, ISBN 978-973-737-846-0.
2. Reactualizarea paginii internet a proiectului: http://genetmicro.blogspot.com/
